**产品名称**：pCR-BluntII-TOPO-ZNF541(human)质粒
**产品规格**：05μg质粒干粉

在收到产品后，请务必根据管壁标签确认产品形式，并在扩增前仔细查阅该质粒菌株的抗性、感受态及培养温度。

pCR-BluntII-TOPO-ZNF541(human)质粒扩增流程

1. **质粒干粉**（常温运输，存于-20℃，保质期90天，必须进行克隆培养，不可直接用于测序）：
① 收到质粒干粉后，先以5000rpm离心1分钟，然后加入20μl去离子水以溶解质粒；
② 取1支100μl感受态细胞于冰上解冻10分钟，随后加入2μl质粒，冰浴30分钟，进行42℃热激60秒，之后不搅动地冰浴2分钟。注意：此步骤必须在超净工作台内进行无菌操作；
③ 加入900μl无抗LB液体培养基，180rpm震荡于37℃培养45分钟；
④ 以6000rpm离心5分钟，保留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布到目标质粒抗性LB平板上；
⑤ 将平板正向培养1小时后，倒置于37℃培养14小时，若需30℃则培养20小时。(如菌落过多，请进行稀释后转化。无菌落时请再加入10μl质粒进行转化。切勿直接转表达感受态，需先转克隆感受态，确认质粒后再导入表达感受态)；
⑥ 挑取单个菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，以220rpm震荡培养14小时，并根据实验需求及质粒提取试剂盒说明书提取质粒。

其他质粒产品说明

2. **甘油菌种**（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，必须进行划线挑单克隆培养）：将菌落四区划线后挑取单菌落进行培养，酵母菌需先液体复苏后再进行划线；
3. **穿刺菌种**（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）：进行穿刺接种，液体培养后划线，再挑取单菌落培养；
4. **菌落平板**（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）：直接挑取单菌落至液体培养基；
5. **液体质粒**（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）：单独提取的液体质粒收到后可直接使用；
6. **滤纸质粒**（常温运输，存于-20℃，保质期90天，必须进行克隆培养）：收到后将滤纸划圈部分剪下放入EP管中，加入100μl无菌水浸湿，泡5分钟后吸取5μl进行转化，随后进行离心全涂。

质粒提取步骤

**实验原理**：
碱裂解法提取质粒是依据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异进行分离。在pH值120-125的狭窄范围内，线性DNA双螺旋结构解链，当加入pH 4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复中性pH时，共价闭合的质粒DNA能迅速复性，而线性染色体DNA则不然，最终通过离心将其排除。

具体操作步骤

1. 准备20ml灭菌过的培养管，编号，加入8ml LB培养基，再加8µl相应抗生素；
2. 用10µl白色枪头挑取单个菌落至培养管中，37℃震荡过夜（274rpm）；
3. 取2ml过夜培养的菌液加入离心管，室温10000rpm离心2分钟，弃去上清；
4. 向留有沉淀的离心管中加入250µl Buffer P1（含RNaseA），混匀后悬浮菌体；
5. 加入250µl Buffer P2，上下颠倒混匀4-6次，获得澄清的裂解液；
6. 加入350µl Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀，室温10000rpm离心15分钟；
7. 小心将上清液转移至洁净的吸收柱中，10000rpm离心1分钟；
8. 加入150µl Buffer PB，10000rpm离心1分钟；
9. 加入400µl Buffer PW（确保加入无水乙醇），10000rpm离心1分钟，再空离一次2分钟；
10. 将吸附柱置于新的离心管中，打开盖子，吹风4分钟以去除乙醇；
11. 向吸附柱中间加90µl Buffer EB（pET系列可用70μl），静置2分钟，10000rpm离心1分钟；
12. 将液体倒回吸附柱，10000rpm离心1分钟；
13. 混合质粒至一离心管中，标记清楚，开盖室温放置2小时，-40℃保存质粒。

注意事项

1. 使用前，将试剂盒中的小管RNA酶加入Buffer P1并4℃保存；
2. Buffer EB在65-70℃水浴预热，以提高提取效率。

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