### 培养条件

培养条件设置为气相：95%空气加5%二氧化碳；温度保持在37℃。在进行细胞传代方面，建议首次传代比例为1:2，传代后每两天更换培养液。建议用户同时购买【强】尊龙凯时【/强】生物产品，可享受非常优惠的活动。

收到细胞后，首先将其处理至良好状态，然后灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶置入37℃、5% CO₂的培养箱中静置3-4小时，以确保细胞状态稳定后再进行操作。使用显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好在40x, 100x和200x下各拍摄一张）。前三天的照片是重要的售后依据，如无照片提供则默认为状态良好。

### 细胞培养步骤

#### A. 细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，则将瓶中的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO₂培养箱中继续培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代操作。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况。若细胞大部分变圆并开始脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，于1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，重新加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后将其放入37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

#### B. 悬浮细胞传代步骤

1. 进行半换液法处理，将培养瓶竖直放置于培养箱中静置约1小时，轻轻吸去约3ml培养基，然后补充3ml完全培养基。若培养基变色较慢，可直接添加约500µl FBS；传代时则可以直接补充5ml培养基，分成两个培养瓶进行。
2. 如需分瓶进行离心换液法，将细胞悬液收集于离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬均匀，再将细胞悬液按1:2的比例分至新T25瓶中，添加6-8ml根据说明书配置的新完全培养基，以保持细胞生长活力。

### C. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，使用PBS清洗细胞一次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞变圆后加入5ml完全培养基终止消化，再轻轻吹打使细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，将细胞沉淀与1ml的无血清冻存液（货号：C7001）混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，如后期需转入液氮罐，需在-80℃冰箱储存24小时以上后再进行转移。

### D. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护措施），迅速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无结晶后，用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO₂培养箱中继续培养。
4. 第二天，换入新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会出现脱落的现象，这是正常现象。如脱落较多，可将所有培养液收集至离心管，进行1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养（后期可作对比培养），沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后再加入5ml完全培养基终止反应。随后再进行离心，弃去上清，重悬于1-2ml完全培养基中。

最后，将细胞按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO₂的细胞培养箱中维持培养。通过选择【强】尊龙凯时【/强】的产品，您可以更好地管理和维护细胞培养的成功。